Reaaliaikaisen RT-PCR: n käyttö Covid-19: ssä

Mikä on reaaliaikainen RT – PCR?

Fluoresoivien geenien lisäämistä PCR-reaktiojärjestelmään, fluoresenssisignaalien kertymisen käyttämistä koko PCR-prosessin seuraamiseksi reaaliajassa ja sitten tuntemattoman templaatin kvantitointia standardikäyrän avulla kutsutaan reaaliaikaisen fluoresenssin kvantitatiiviseksi PCR-tekniikaksi, joka tunnetaan myös nimellä reaaliaikainen Q -PCR.

PCR-monistuksen periaate on sama kuin tavallisessa PCR-instrumentissa, paitsi että PCR-monistuksen aikana lisätyt alukkeet on merkitty isotoopeilla, fluoreseiinilla jne. Ja alukkeita ja fluoresoivia koettimia käytetään sitoutumaan spesifisesti templaattiin monistamiseksi samaan aikaan.

Vahvistetut tulokset kerätään ja lähetetään tietokoneanalyysi- ja prosessointijärjestelmään fluoresenssisignaalien keräysjärjestelmän reaaliaikaisen keräyssignaalin välityksellä kvantitatiivisen reaaliaikaisen tuloksen tuottamiseksi.

Reaaliaikainen RT – PCR on yksi yleisimmin käytetyistä laboratoriomenetelmistä COVID-19-viruksen havaitsemiseksi. Vaikka monet maat ovat käyttäneet reaaliaikaista RT-PCR-menetelmää muiden sairauksien, kuten Ebola-viruksen ja Zika-viruksen, diagnosointiin, monet tarvitsevat tukea tämän menetelmän mukauttamisessa COVID-19-virukseen ja kansallisten testausvalmiuksien lisäämiseen.

Kuinka reaaliaikainen RT-PCR toimii COVID-19-viruksen kanssa?

Näyte kerätään ruumiinosista, joihin COVID-19-virus kerääntyy, kuten henkilön nenästä tai kurkusta. Näyte käsitellään useilla kemiallisilla liuoksilla, jotka poistavat aineita, kuten proteiineja ja rasvoja, ja jotka uuttavat vain näytteessä olevan RNA: n. Tämä uutettu RNA on sekoitus ihmisen omaa geneettistä materiaalia ja, jos sitä on, viruksen RNA: ta.

RNA transkriptoidaan käänteisesti DNA: han käyttämällä tiettyä entsyymiä. Tutkijat lisäävät sitten lisää lyhyitä DNA-fragmentteja, jotka ovat komplementaarisia transkriboidun virus-DNA: n spesifisille osille. Jos virus on näytteessä, nämä fragmentit kiinnittyvät virus-DNA: n kohdeosiin. Joitakin lisätyistä geneettisistä fragmenteista käytetään DNA-juosteiden rakentamiseen monistamisen aikana, kun taas toisia käytetään DNA: n rakentamiseen ja merkkiaineiden lisäämiseen säikeisiin, joita sitten käytetään viruksen havaitsemiseen.

Sitten seos pannaan RT-PCR-koneeseen. Kone kiertää lämpötiloissa, jotka lämmittävät ja jäähdyttävät seosta, käynnistäen spesifisiä kemiallisia reaktioita, jotka luovat uusia, identtisiä kopioita virus-DNA: n kohdeosista. Sykli toistetaan yhä uudelleen virus-DNA: n kohdeosien kopioinnin jatkamiseksi. Jokainen jakso kaksinkertaistaa edellisen numeron: kahdesta kopiosta tulee neljä, neljästä kopiosta kahdeksan ja niin edelleen. Tavanomainen reaaliaikainen RT – PCR-asetukset läpikäyvät yleensä 35 sykliä, mikä tarkoittaa, että prosessin loppuun mennessä näytteessä olevan viruksen jokaisesta juosteesta luodaan noin 35 miljardia uutta kopiota virus-DNA: n osista. .

Kun virus-DNA-osastoista rakennetaan uusia kopioita, merkitsimet kiinnittyvät DNA-juosteisiin ja vapauttavat sitten fluoresoivan väriaineen, joka mitataan koneen tietokoneella ja esitetään reaaliajassa näytöllä. Tietokone seuraa näytteen fluoresenssin määrää jokaisen jakson jälkeen. Kun tietty fluoresenssitaso ylitetään, tämä vahvistaa viruksen esiintymisen. Tutkijat seuraavat myös kuinka monta sykliä tarvitaan tämän tason saavuttamiseksi infektion vakavuuden arvioimiseksi: mitä vähemmän jaksoja, sitä vakavampi virusinfektio on.

Miksi käyttää reaaliaikaista RT – PCR: ää?

Reaaliaikainen RT-PCR-tekniikka on erittäin herkkä ja spesifinen, ja se voi antaa luotettavan diagnoosin vain kolmessa tunnissa, vaikka laboratoriot vievätkin keskimäärin kuusi ja kahdeksan tuntia. Verrattuna muihin saatavilla oleviin viruksen eristysmenetelmiin, reaaliaikainen RT-PCR on huomattavasti nopeampi ja sillä on pienempi kontaminaatio- tai virhevirhe, koska koko prosessi voidaan suorittaa suljetussa putkessa. Se on edelleen tarkin käytettävissä oleva menetelmä COVID-19-viruksen havaitsemiseksi.

Reaaliaikaista RT-PCR: ää ei kuitenkaan voida käyttää aiempien infektioiden havaitsemiseen, mikä on tärkeää viruksen kehityksen ja leviämisen ymmärtämiseksi, koska viruksia esiintyy kehossa vain tietyn ajanjakson ajan. Muut menetelmät ovat välttämättömiä aiempien infektioiden havaitsemiseksi, jäljittämiseksi ja tutkimiseksi, etenkin niiden, jotka ovat mahdollisesti kehittyneet ja leviäneet ilman oireita.